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猪圆环病毒II型四川株的全基因克隆及序列分析

时间:2011-07-22 12:50:56  来源:  作者:朱玲
朱玲,郭万柱**,徐志文,王新,殷华平,王小玉
(四川农业大学动物生物技术中心,雅安 四川 625014)
 
摘要:本试验通过从可疑病料中直接提取DNA为模板,参照Genbank中参考序列设计一对特异性引物,一次反应扩增获得长约1800bp的目的片段,克隆入pMD18-T获得阳性重组质粒,经酶切鉴定和序列测定结果表明该质粒含有长1767bp 的PCV-2全基因组,将其命名为pMD18-T-PCV-2-SC。通过BLAST与GenBank中来自美洲、欧洲及中国的部分PCV-2毒株进行同源性比较分析,结果毒株间的同源性介于93.6-98.6%。该结果表明我们所采病料中含有PCV-2病毒,将该毒株命名为PCV-2-SC株。将其主要ORF与其它PCV2毒株进行了比较,结果PCV2-SC株的ORF1与16个毒株的ORF1之间同源性为94.7-99.4%;ORF2的同源性则为90.3-99.6%。
关健词:猪圆环病毒II型;全基因;克隆;序列分析
中图分类号:S858.285.3
 
自证实猪II型圆环病毒( porcine circovirus-II,PCV-2)为猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaning multi-systemic wasting syndrome,PMWS)主要病原以来,该病现已在全球范围内被认识,并被看成是造成猪场主要经济损失的原因,已引起世界各国的广泛重视。临床上也常与细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)等混合感染,更加重和促进了PMWS疾病的发生。PCV-2又是引起猪的繁殖障碍、猪增生性坏死性肺炎(PNP)、皮炎与肾病综合征(PDNS)、幼龄猪的先天性震颤(CT)等疾病的重要致病因子[1]。已成为影响养猪业发展的重要传染病病原之一。至今为止,还未研制出确实有效的疫苗用于PCV-2引起的系列疾病的预防和控制,致使PMWS等疾病有不断蔓延之势。PCV-2基因组全长1767或1768bp,含有11个可能的开放阅读框架(ORF)ORF1和ORF2是2个主要的阅读框架。ORF1编码与病毒复制相关的Rep和Rep’蛋白,它的缺失或突变将导致病毒不能复制;ORF2编码主要的结构蛋白,且该蛋白具有良好的免疫原性[2]。其他ORFs编码的蛋白是否具有免疫原性以及免疫原性如何,目前尚不清楚。本研究旨在通过克隆PCV-2 四川株(SC株)的全基因,通过序列测定及部分生物信息学分析,为开展相关疫病的分子流行病学、分子诊断技术、基因工程疫苗等研究奠定基础。 
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病料 病料来源于四川雅安某规模化猪场,发病猪群表现为发育不良、衰竭、消瘦、呼吸困难、全身淋巴结特别是体表淋巴结肿大,皮肤苍白和部分猪只出现黄疸。选疑似病例,采集肺脏、脾脏、淋巴结等组织,保存备用。
1.1.2质粒及菌株 PMD18-T购自宝生物工程(大连)有限公司;DH5a宿主菌由四川农业大学动物生物技术中心保存。
1.1.3 工具酶及试剂 PCR试剂盒、限制性内切酶SacII、T4 DNA Ligase及DNA回收试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2 方法
1.2.1模板DNA的制备 取疑似病例的肺脏、脾脏及淋巴结少许,剪碎,加入适量PBS研磨成匀浆,反复冻融三次,37℃水浴30min,3000r/min离心取上清,加入10%SDS 100ul、10mg/ml的蛋白酶K 25ul 50℃水浴作用1h;酚/氯仿抽提,乙醇沉淀,DNA溶于TE中备用。
1.2.2 引物设计与合成 参照Genbank中的现有全序列,利用DNAstar分析PCV-2全基因组中无SacII酶切位点。利用该特点,在上下游引物中引入SacII位点,以利于后期基因操作。引物序列组成如下:P1:5‘-gAACCgCggCTggCTAACTTTgAAAgT-3’;
P2: 5‘-gCACCgCggAATTCTgACAACgTTACA-3’。
1.2.3 PCR扩增 50ul反应体系(5ul 10×bufffer、3ul 25mmol/L Mgcl2、1ul 10mmol/L dNTPs、20umol/L P1和P2各1.0ul、EX-Taq酶0.5ul、模板3ul、超纯水补足50ul)于94℃变性5min,然后进行30个循环(94℃ 1min,56℃ 1min,72℃ 1min30s),最后72℃延伸10min。
1.2.4 PCR产物的纯化及克隆鉴定 参照文献[3],回收PCR产物,溶于TE中备用;将产物与pMD-18T载体进行连接;常规方法转化大肠杆菌DH5а感受态细胞,含Amp 的x-gal平板上37℃培养12h;挑取白色单个菌落接种含Amp 的LB肉汤,37℃振荡培养过夜,Lysis Triton法提取质粒DNA,用限制性核酸内切酶SacII作初步鉴定。
1.2.5 序列分析 将经初步鉴定的阳性重组质粒送大连宝生物工程有限公司测序,测序结果用Bioedit软件与Genbank公布的部分国内外流行毒株进行比较分析。 
2 结 果
2.1 PCR扩增 用从可疑病料中提取的DNA为模板,利用根据Genbank中现有序列设计一对特异性引物P1/P2进行PCR扩增,取5ul扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果获得了与预期结果相符、大小约1800bP的片段(图1)。
2.2 重组质粒的酶切鉴定 按操作说明将PCR产物与pMD-18T进行连接并转化大肠杆菌DH5a,筛选白色的表型阳性重组子,用SacII酶进行初步鉴定,结果表明克隆是确实的(图2),将该阳性重组质粒命名为pMD-18T-PCV-2-SC。

2.3 序列测定与分析 经大连宝生物工程有限公司测定阳性重组质粒,克隆有长为1778bp的外源片段,去除酶切位点及保护性碱基,该片段1768bp与预期结果完全相符。通过BLAST与GenBank中来自美洲、欧洲及中国的部分PCV-2毒株进行同源性比较分析,结果17个毒株间的同源性介于93.6-98.6%(图3)。与PCV-1毒株相比其同源性则仅为。该结果表明我们所采病料中含有PCV-2病毒,将该毒株命名为PCV-2-SC株。进一步分析结果表明PCV-2-SC株与本次比较的(AY181946 Tianjin株)亲缘关系最近,同源性高达98.6%;与(AF364094 Taiwan株)亲缘关系最远,同源性为93.6%(图4)。
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