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人兽共患蛔虫的分子分类学及分子遗传学研究进展*

时间:2011-07-25 14:30:07  来源:  作者:朱兴全

朱兴全 李明伟 马妮妮 宋慧群 林瑞庆
(华南农业大学兽医学院 广州 510642)

      摘要:蛔虫总科的寄生线虫可感染主要的脊椎动物种类,其中的许多种还可感染人,引起严重的临床疾病,具有重要的公共卫生学意义。对蛔虫的各个生长发育期进行准确的鉴定是研究它们的生活史、流行病学、种群生物学和系统学的一个必要前提,同时也有助于对它们所导致的疾病进行诊断。近年来一些基于PCR的分子生物学方法(如PCR-RFLP及PCR-SSCP),以核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)作为遗传标记,已成功用于蛔虫的分子分类学及分子遗传学研究。本文概述近年来作者利用ITS序列作为遗传标记,将基于PCR的多种分子生物学方法在人兽共患蛔虫的虫种特异性鉴定、感染的诊断、种群遗传变异研究中应用的研究成果。
      关键词: 蛔虫;内转录间隔区(ITS);PCR;PCR-RFLP;PCR-SSCP;分子分类学;分子遗传学

Advances in the studies on molecular taxonomy and genetics of ascaridoids with zoonotic potential
ZHU Xing-quan MA Ni-ni Song Hui-Qun LIN Rui-qing
(College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University,Guangzhou 510642, China)

      Abstract The superfamily Ascaridoidea comprises some 50 genera which parasitise all major groups of vertebrates, and some of these ascaridoids are of major animal and/or human health significance. Species-specific identification of ascaridoids at any developmental stage is central for detailed investigation of their life-cycles, systematics and epidemiology, and is also crucial for the diagnosis of diseases they cause. Recently, PCR-based methods, using genetic markers in the internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA, have been shown to provide reliable alternatives to more traditional methods for the specific identification of ascaridoids. This article summarizes recent research on the development of PCR-based methods (utilising ITS sequences) for the specific identification of ascaridoid nematodes of zoonotic potential, for the diagnosis of infections, and for the analysis of genetic variation in this important parasite group.
      Key Words: Ascaridoid; internal transcribed spacers (ITS); PCR; PCR-RFLP;PCR-SSCP; Molecular taxonomy; Molecular genetics
      蛔虫总科的寄生线虫可感染主要的脊椎动物种类,这些蛔虫不仅严重危害动物健康及生命,而且许多蛔虫还可感染人,引起严重的临床疾病,具有重要的公共卫生学意义[1-11]。例如,犬弓首蛔虫的幼虫可以侵入人体各组织,引起内脏幼虫移行症(visceral larva migrans,VLM)、眼睛幼虫移行症(ocular larva migrans,OLM)和隐性弓首蛔虫病[8,11]。再如,寄生于淙熊的一种贝利斯蛔虫(Baylisascaris procyonis)同样可以引起人的VLM、OLM和脑脊髓性线虫病[5,9]。再如,具有重要公共卫生学意义的人蛔虫仍在世界上许多国家广泛流行[12,13]。由于食入寄生在海鱼体内的、属于异尖线虫科(Anisakidae)某些种的活的第三期幼虫而引起的异尖线虫病,已成为重要的食源性人兽共患寄生虫病,严重威胁人类的健康,是我国禁止入境的二类寄生虫病[4,6,10]。
      鉴于蛔虫对人和动物健康的重要意义,开展蛔虫的研究无疑是十分必要的,而对蛔虫的各个生长发育阶段进行准确的鉴定是研究它们的生活史、流行病学、种群生物学和系统学的一个必要前提,同时也是对蛔虫感染进行诊断的一个重要条件。过去,对蛔虫的鉴定主要根据成虫的形态学特征、宿主特异性及特定的寄生部位。但是对于形态上难于区别的虫卵和幼虫阶段,形态学方法有时则具有局限性。本文结合我们自已的研究工作,对近年来在人兽共患蛔虫的分子分类学及分子遗传学方面的研究成果作一概述。
1.蛔虫PCR鉴别和诊断方法中目的DNA的选择
      在分子分类学及分子遗传学研究中,必须选择适当的DNA序列作为遗传标记。由于不同的基因进化速率不尽相同,因此所选择的目的DNA应该能够在所要求的分类学水平上对寄生虫鉴别提供足够的序列变异。在“虫种”的水平上进行区分,需要选择在种内无或者仅有很低变异,但在种间差异较大的序列;而对于“虫株”的研究,则要选择一些种内有较大序列变异的DNA片段作为遗传标记。重复DNA(卫星DNA)[14]、线粒体DNA(mtDNA)[15]以及核糖DNA(rDNA)[16]等多种DNA区域都可被用来作为寄生虫虫种或株鉴别的遗传标记。rDNA是由许多重复序列串联组成的庞大的多基因家族,通常呈团聚集在特异性染色体上。rDNA通常是由小亚基rRNA基因(如18S)和大亚基rRNA基因(如28S)串联而成,两个大小亚基之间存在间隔区序列,它包括两个内转录间隔区(ITS-1,ITS-2)和5.8S rRNA基因。rDNA的进化进程呈突变性变化,而且序列表现出协同进化,后者导致了序列的相似性,在同种内序列的相似性远大于种间序列的相似性。近年来的一些研究表明,rDNA的ITS-1序列和ITS-2序列可为线虫种的鉴定提供可靠的遗传标记,即使对于那些关系很近或者形态学相似的种,如捻转血矛线虫和柏氏血矛线虫,这些遗传标记都仍然适用。因此,rDNA的ITS-1序列和ITS-2序列被选择作为遗传标记,用于人兽共患蛔虫的分子分类学及分子遗传学研究。
2.对ITS序列的初步评价以及用于蛔虫特异性鉴定的PCR方法的建立
      Jacobs等(1997)[17]首次报道,在犬弓首蛔虫成虫、猫弓首蛔虫成虫和狮弓蛔虫成虫之间,ITS-2序列种间差异为26%-50%,而种内变异仅0-0.6%)。结果表明,ITS-2序列可为这三种在兽医和医学上具有重要意义的蛔虫提供种特异的遗传标记。根据这些分子标记,用PCR-RFLP(使用核酸内切酶Hinf I和Rsa I)及特异PCR方法可以将犬弓首蛔虫成虫、猫弓首蛔虫成虫和狮弓蛔虫成虫彼此清楚地区分开来。而且所建立的特异PCR方法的特异性好,不仅不扩增人蛔虫、贝利斯蛔虫、猪蛔虫及牛弓首蛔虫的DNA,而且也不扩增人、犬、猫的DNA;表明通过特异PCR检测人体或动物体内的蛔虫幼虫时,不需要事先对虫体进行分离。
      Jacobs等人在蛔虫领域开拓性的研究不仅证明ITS-2序列可为犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和狮弓蛔虫的鉴定提供种特异性遗传标记,而且为建立比PCR-RFLP更加敏感的分子分类学方法、解决蛔虫分类及鉴定中的问题奠定了基础。李明伟等根据ITS-1及ITS-2序列设计种特异的引物,建立了用于区别犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫(见[18])和狮弓蛔虫的特异PCR方法(待发表资料)。
3.PCR-SSCP:一种用于鉴定蛔虫和检测种群变异的基因突变检测方法
      在自然界中,寄生虫的遗传变异普遍存在,分析研究这些遗传变异对它们的分类、分型和鉴定以及流行病学的研究等方面均具有重要意义。寄生线虫个体内及个体间的遗传变异情况可以用高分辨率的基因突变扫描技术[19,20]来进行分析。单链构象多态性(SSCP)就是这样一种技术,其原理是: PCR产物经热变性或化学变性后形成单链,在非变性聚丙烯酰胺凝胶中泳动时,单链DNA分子的电泳迁移率不仅与DNA片段的长度有关,而且还与单链DNA所形成的空间构象有关。在单链DNA分子中,由于核苷酸之间的碱基配对,使单链DNA分子发生二级及三级构象,这些构象取决于单链DNA分子的长度、碱基组成、碱基配对区的位置及数量。当条件最佳时,对于相同长度的单链DNA来说,因其核苷酸组成或顺序不同,其空间构象就不一样。甚至在某一特定位置的一个碱基变化亦可改变分子构象,从而导致在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率发生改变[19-22]。

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