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不同日粮蛋白水平对猪脂肪组织脂类合成代谢相关基因表达的影响

时间:2012-01-12 09:39:20  来源:  作者:赵素梅
赵素梅,王静,高士争
(云南农业大学云南省动物营养与饲料重点实验室,昆明,650201)
摘要:本研究探讨不同日粮蛋白水平对乌金猪脂肪组织脂类合成代谢相关基因表达的影响。选取健康、体重约15kg的乌金猪27头,随机分为3组,设3个蛋白水平,在15-30kg,30-60kg和60-100kg生长阶段分别为低蛋白水平(14%、12% 和10%)、中蛋白水平(16%、14% 和12%)和高蛋白水平(18%、16% 和14%)。乌金猪体重为30kg、60kg和100kg时屠宰取皮下脂肪组织样品,提取总RNA,反转录,Real-time PCR 定量检测脂肪组织脂肪合成代谢相关酶和因子的基因表达水平。结果表明:高蛋白日粮显著降低乌金猪脂肪组织脂肪合成代谢相关基因(ACC、FAS和SREBP-1c)在60kg和100kg体重时的表达,而30kg体重时FAS mRNA被显著提高。该结果指示,高蛋白日粮可显著影响脂肪组织脂类合成代谢相关基因及脂肪酸转运基因在不同体重时的基因表达。
关键词:日粮蛋白;脂肪组织;合成代谢;基因表达;乌金猪
Impact of Dietary Protein Levels on Lipid anabolism Related Gene expression in Adipose Tissue of Wujin Pigs
ZHAO Sumei , WANG Jing, Gao Shizheng
(Yunnan Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science, Yunnan Agricultural University, Kunming, 650201, China)
Abstract: The experiments were performed to identify the molecular mechanism that different protein levels on fat deposition in animal adipose tissue. [Method] Twenty-seven Wujin pigs were randomly assigned to 3 groups and imposed on three different protein levels with low dietary protein (14%, 12% and 10%), middle dietary protein (16%, 14% and 12%) or high dietary protein (18%, 16% and 14%) during the growth stages of 15-30, 30-60 and 60-100kg body weights. Pigs were slaughtered and subcutaneous adipose tissue were taken for analyzing lipid anabolism related gene expression by real-time PCR. The results showed that: High dietary protein could significantly reduce the gene expression of ACC, FAS and SREBP-1c  at the body weights of 60kg and 100kg, but the mRNA concentration of FAS was increased at 30 kg body weight. The mechanism for different dietary protein levels to impact adipose tissue lipid filling is through regulating the gene expression of enzymes and factors for fatty acid synthesis and transport.
Key words: dietary protein, adipose tissue, lipid anabolism, gene expression, Wujin pigs 
引言
猪的脂肪组织是脂肪酸合成的主要部位。合成甘油三酯所需要的脂肪酸大多来自于脂肪酸的从头合成(de novo fatty acid synthesis)。乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase, ACC)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)复合体系催化乙酰辅酶A合成脂肪酸。固醇调节元件结合蛋白(sterol regulator element binding protein,SREBP)是一类含有碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链基序的膜结合转录因子[16],能够激活编码胆固醇和脂肪酸生物合成的酶基因
目前关于日粮蛋白水平对乌金猪胴体品质及肉品质的影响尚缺乏深入研究,本研究通过检测不同日粮蛋白水平对乌金猪脂肪组织中相关的脂类合成代谢基因(ACC、FAS、SREBP-1c)表达的影响,对阐明乌金猪脂肪组织脂类合成代谢的分子基础,为进一步研究乌金猪在脂肪沉积过程中的变化规律,以充分利用云南优良地方猪种资源具有重要意义。
1 材料与方法
1.试验动物及分组
选取健康、胎次相近、体重约15kg的乌金猪27头,随机分为3组,每组9头,每组分别饲喂3个蛋白水平的日粮。正式试验开始前进行5天的预饲,预饲期结束后进入正式试验期。
1.2 试验日粮
根据中国地方猪饲养标准,按试验猪的各生长阶段营养需要配制不同阶段的日粮。日粮不同蛋白设立3个水平,以中国地方猪饲养水平蛋白需求为中值(中蛋白组:15-30kg:16%;30-60kg:14%;60-100kg:12%),在此水平上下各设2个蛋白水平,在15-30、30-60和60-100kg生长阶段分别为高蛋白组:18%、16%和14%;低蛋白组:14%、12%和10%,微量元素、氨基酸等其余水平固定。
1.3 Real-Time PCR
乌金猪皮下脂肪组织中总 RNA 用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取。各取2µg总RNA进行反转录,反应体积为20µl。所有基因的引物使用Primer v5软件设计,目的基因和内标基因(β-actin)的引物序列根据GenBank上猪的基因序列设计,引物登陆号及引物序列见表3。Real-TimePCR反应体系为20µL:1.5 µl RT产物,10µl iQTM SYBR® Green Supermix (BIO-RAD, 美国),0.25 mmol/µL dNTP, 0.5 mmol/L 目的基因引物。每样品做2次重复,同时用 ddH2O 代替RT产物和荧光试剂作空白对照,以检验是否有外源基因和基因组DNA 污染。PCR反应条件如引物浓度、退火温度,读板温度等都需进行优化,使目的基因和内标基因的扩增效率接近于1。采用荧光定量实时PCR对各基因的表达进行相对定量。
表1内标基因和目的基因的引物序列、产物长度及登陆号

目的基因
引物序列
退火
温度
产物大小
GenBank
登录号
β-actin
F:5’-ACT GCC GCA TCC TCT TCC TC-3’
R:5’-CTC CTG CTT GCT GAT CCA CAT C-3’
55℃
399 bp
766-1164)
BC063166
ACC
F:5’- ATG TTT CGG CAG TCC CTG AT-3’
R:5’- TGT GGA CCA GCT GAC CTT GA-3’
60℃
133 bp
4810-4942)
EF618729
FAS
F:5’-AGC CTA ACT CCT CGC TGC AAT-3’
R:5’-TCC TTG GAA CCG TCT GTG TTC-3’
58℃
196 bp
504-699)
AY183428
SREBP-1c
F:5’-GCG ACG GTG CCT CTG GTA GT-3’
R:5’-CGC AAG ACG GCG GAT TTA-3’
62℃
218 bp
194-411)
AF102873

1.4 数据分析
采用SAS 9.0软件对试验数据进行统计分析,所有数据表示为平均值±标准差,并对平均值进行方差分析,作显著性检验(P < 0.05)。
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